本發(fā)明涉及生物。具體地，本發(fā)明涉及支氣管上皮干/祖細胞的培養(yǎng)方法。

背景技術：

1、小氣道指直徑小于2mm的氣道，目前認為在呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)展的初期，小氣道梗阻對氣道阻力的變化影響很小，故也被稱為肺部疾病的沉默區(qū)。然而，在疾病進展期，小氣道阻塞會顯著影響肺功能。

2、最大呼氣中段流速(mmef)、呼出50％肺活量時最大呼氣流量(fef50)和呼出75％肺活量時最大呼氣流量(fef75)指標中有兩項低于預計值的65％可判斷為小氣道功能障礙。(https://doi.org/10.1016/s2213-2600(20)30155-7)

3、根據(jù)研究結果，在我國20歲及以上人群中，43.5％的人有小氣道功能障礙，總人數(shù)約為4.26億。而在吸入支氣管擴張劑前第一秒用力呼氣容積(fev1)及第一秒用力呼氣容積占用力肺活量比值(fev1/fvc)正常的人群中，25.5％存在小氣道功能障礙，總人數(shù)約為2.53億；在吸入支氣管擴張劑前后fev1及fev1/fvc均正常的人群中，11.3％存在小氣道功能障礙，總人數(shù)約為1.11億。此外，在研究人群中，幾乎所有慢性阻塞性肺疾病患者(96.15％)存在小氣道功能障礙，而哮喘患者中存在小氣道功能障礙者占68.97％。

4、即使在沒有罹患慢性阻塞性肺疾病、哮喘的人群中，也有41.3％存在小氣道功能障礙。這些數(shù)字提示了小氣道功能障礙可能在慢性阻塞性肺疾病、哮喘出現(xiàn)之前就已經(jīng)存在，需要引起衛(wèi)生工作者與臨床醫(yī)生更多的重視。

5、近十年的研究證明，在慢性阻塞性肺疾病(copd)患者中，普遍存在以小氣道壁增厚、上皮變化為特征的炎性細胞浸潤、粘液阻塞管腔以及氣道平滑肌增生和支氣管周圍纖維化等病理學改變。不僅是在copd中，小氣道壁增厚在哮喘中也很常見，且與呼吸困難和哮喘加重的頻率和嚴重程度有關。另有一項前瞻性研究認為：小氣道功能障礙可能早于哮喘的發(fā)展，因此小氣道功能障礙也被認為是copd和哮喘的前兆。

6、小氣道病變和相關的疾病主要包括以下幾種：1.小氣道炎癥：慢性阻塞性肺疾病(copd)中，小氣道炎癥是重要的病理生理變化之一，包括粘液的高分泌、杯狀細胞大量的擴張和增生、鱗狀上皮細胞化生、氣道壁增厚和纖維化、平滑肌的增生和肥大等。2.氣道狹窄：小氣道炎癥會導致氣道管壁的增厚和管腔的狹窄，根據(jù)泊肅葉定律，氣道阻力與氣道內(nèi)徑的4次方成反比，氣道內(nèi)徑狹窄時，氣道阻力會顯著升高。3.小氣道功能障礙(sad)：小氣道病變或肺彈性下降導致小氣道氣流呼出受限，但達不到阻塞性通氣功能障礙診斷標準的病理生理狀態(tài)，被認為是哮喘和慢阻肺等慢性氣道疾病的早期信號。4.黏液分泌增加：長期、反復的炎癥可能導致黏液分泌增加，這是小氣道功能障礙的一個特征。5.肺泡喪失：長期炎癥還可能導致肺泡喪失，這是小氣道功能障礙的另一個特征。6.細支氣管狹窄和肺泡破壞：在慢阻肺病患者中，小氣道常存在黏液過量、細支氣管狹窄和肺泡破壞等病理改變。7.小氣道擴張：在特發(fā)性肺纖維化(ipf)患者中，小氣道擴張較為明顯，可能與肺實質纖維化程度較重而引起牽拉性小氣道擴張有關。8.影像學表現(xiàn)：高分辨率ct(hrct)可見小氣道病變征象包括直接特征和間接影像學特征。直接癥狀主要是小葉中央結節(jié)和樹芽征，間接癥狀包括馬賽克衰減、楔形磨玻璃區(qū)、圓柱形細支氣管擴張等。這些病變特征表明小氣道損傷與多種慢性氣道疾病的發(fā)展密切相關，并且對患者的呼吸功能和臨床結局有顯著影響。

7、小氣道病變病因較為復雜，目前沒有針對小氣道病變的有效藥物和療法。臨床上目前有用干細胞進行治療的臨床試驗的嘗試，主要是間充質干細胞，間充質干細胞無法分化為肺部的細胞，無法完成對小氣道損傷的修復，因此效果不令人滿意。另外有肺干細胞用于治療copd的臨床試驗的嘗試，從發(fā)表的數(shù)據(jù)上來看，對肺功能的改善不明顯。

8、目前的支氣管上皮干/祖細胞技術，培養(yǎng)代次受限，成本較高，克隆形成率較低，應用于臨床試驗上改善肺功能的效果不顯著。

9、因此，本領域迫切需要開發(fā)一種可以提高支氣管上皮干/祖細胞克隆率，并實現(xiàn)多次傳代擴增，細胞干性維持正常，保持正常分化潛能的方法。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明公開了一種可以提高支氣管上皮干/祖細胞克隆率，實現(xiàn)支氣管上皮干/祖細胞多次傳代擴增，并實現(xiàn)大于50次傳代擴增，支氣管上皮干/祖細胞干性維持正常，保持正常分化潛能的方法。

2、在本發(fā)明第一方面，提供了一種培養(yǎng)支氣管上皮干/祖細胞的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基和添加物；其中所述基礎培養(yǎng)基選自下組：dmem、ham'sf-12、dmem/f-12、或其組合，所述添加物包括：胎牛血清、葡萄糖、胰島素、表皮生長因子、氫化可的松、y-27632、sb431542、noggin、r-spondin?1、fibronectin、e-cadherin。

3、在另一優(yōu)選例中，所述基礎培養(yǎng)基包括dmem和ham's?f-12。

4、在另一優(yōu)選例中，以所述培養(yǎng)基總體積計，所述基礎培養(yǎng)基的濃度(體積百分比)為80-90％。

5、在另一優(yōu)選例中，以所述培養(yǎng)基總體積計，所述dmem和ham's?f-12的體積比為0.5-2：0.5-2，優(yōu)選1:1。

6、在另一優(yōu)選例中，以所述培養(yǎng)基總體積計，所述胎牛血清的濃度(體積百分比)10-20％。

7、在另一優(yōu)選例中，以所述培養(yǎng)基總體積計，所述葡萄糖的濃度為1000-5000mg/l，較佳地，1500-4500mg/l，更佳地，2000-4000mg/l，更佳地，2500-3500mg/l。

8、在另一優(yōu)選例中，以所述培養(yǎng)基總體積計，胰島素的濃度為0.1-100μg/ml，較佳地，0.3-80μg/ml，更佳地，0.5-50μg/ml，更佳地，0.8-30μg/ml，更佳地，1-10μg/ml，更佳地，3-10μg/ml。

9、在另一優(yōu)選例中，以所述培養(yǎng)基總體積計，表皮生長因子的濃度為0.1-100ng/ml，較佳地，0.5-80ng/ml，更佳地，0.7-50ng/ml，更佳地，0.8-30ng/ml，更佳地，1-20ng/ml，更佳地，2-10ng/ml。

10、在另一優(yōu)選例中，以所述培養(yǎng)基總體積計，氫化可的松的濃度為0.1-100μg/ml，較佳地，0.3-50μg/ml，更佳地，0.8-30μg/ml，更佳地，1-10μg/ml，更佳地，1-6μg/ml。

11、在另一優(yōu)選例中，以所述培養(yǎng)基總體積計，y-27632的濃度為0.1-100μm，較佳地，0.3-50μm，更佳地，0.8-30μm，更佳地，1-10μm，更佳地，1-6μm。

12、在另一優(yōu)選例中，以所述培養(yǎng)基總體積計，sb431542的濃度為1-100μm，較佳地，5-60μm，更佳地，8-20μm，更佳地，8-15μm。

13、在另一優(yōu)選例中，以所述培養(yǎng)基總體積計，noggin的濃度為1-500ng/ml，較佳地，5-300ng/ml，更佳地，8-200ng/ml，更佳地，10-100ng/ml，更佳地，20-50ng/ml。

14、在另一優(yōu)選例中，以所述培養(yǎng)基總體積計，r-spondin?1的濃度為1-500ng/ml，較佳地，5-300ng/ml，更佳地，8-200ng/ml，更佳地，10-100ng/ml，更佳地，30-80ng/ml。

15、在另一優(yōu)選例中，以所述培養(yǎng)基總體積計，fibronectin的濃度為0.1-100μg/ml，較佳地，0.5-50μg/ml，更佳地，08-30μg/ml，更佳地，1-10μg/ml，更佳地，1-6μg/ml。

16、在另一優(yōu)選例中，以所述培養(yǎng)基總體積計，e-cadherin的濃度為0.01-10μg/ml，較佳地，0.05-5μg/ml，更佳地，0.08-3μg/ml，更佳地，0.1-2μg/ml，更佳地，0.6-2μg/ml。

17、本發(fā)明第二方面提供了一種用于培養(yǎng)支氣管上皮干/祖細胞的培養(yǎng)基試劑盒，包括：

18、(a)第一容器以及位于第一容器內(nèi)的添加物，所述添加物包括：胎牛血清、葡萄糖、胰島素、表皮生長因子、氫化可的松、y-27632、sb431542、noggin、r-spondin?1、fibronectin、e-cadherin。

19、在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基試劑盒還包括：

20、(b)第二容器以及位于第二容器內(nèi)的基礎培養(yǎng)基。

21、在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基試劑盒還包括：

22、(c)第三容器以及位于第三容器內(nèi)的滋養(yǎng)層細胞，所述滋養(yǎng)層細胞經(jīng)輻照成纖維細胞而得。

23、在另一優(yōu)選例中，所述輻照劑量為20-80gy，優(yōu)選30-60gy。

24、在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基試劑盒還包括：

25、(d)第四容器以及位于第四容器內(nèi)的支氣管上皮干/祖細胞。

26、在另一優(yōu)選例中，所述基礎培養(yǎng)基選自下組：dmem、ham's?f-12、dmem/f12、或其組合。

27、在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基試劑盒用于配制如本發(fā)明第一方面所述的支氣管上皮干/祖細胞培養(yǎng)基。

28、在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基試劑盒還包括：說明書，所述說明書中記載了所述培養(yǎng)基試劑盒中各組分的濃度以及配制如本發(fā)明第一方面所述的支氣管上皮干/祖細胞培養(yǎng)基的方法。

29、在另一優(yōu)選例中，所述說明書還記載了配制如本發(fā)明第一方面所述的支氣管上皮干/祖細胞培養(yǎng)基時，所述培養(yǎng)基試劑盒中各組分的指導使用濃度。

30、在另一優(yōu)選例中，所述第一容器、第二容器、第三容器、第四容器可以是相同(同一)或不同的容器。

31、本發(fā)明第三方面提供了一種支氣管上皮干/祖細胞的培養(yǎng)方法，所述方法包括步驟：

32、(s1)提供離體支氣管上皮樣本和滋養(yǎng)層細胞，所述滋養(yǎng)層細胞經(jīng)輻照成纖維細胞而獲得；

33、(s2)對所述樣本進行離心，清洗，消化，得到含有支氣管上皮干/祖細胞的細胞懸浮液；

34、(s3)將所述含有支氣管上皮干/祖細胞的細胞懸浮液接種到所述滋養(yǎng)層細胞上，在本發(fā)明第一方面所述的培養(yǎng)支氣管上皮干/祖細胞的培養(yǎng)基的存在下進行培養(yǎng)，從而獲得所述支氣管上皮干/祖細胞。

35、在另一優(yōu)選例中，所述支氣管上皮樣本為正常支氣管上皮樣本或病理支氣管上皮樣本。

36、在另一優(yōu)選例中，所述支氣管上皮樣本來自細支氣管，優(yōu)選5級及以上細支氣管。

37、在另一優(yōu)選例中，所述支氣管上皮樣本選自下組：組織樣本、無創(chuàng)液體樣本、組織活檢鉗取樣本、活檢刷取樣本、手術切取樣本、或其組合。

38、在另一優(yōu)選例中，步驟(s2)中的離心條件為：300-1000g。

39、在另一優(yōu)選例中，步驟(s2)中，使用組織清洗液清洗。

40、在另一優(yōu)選例中，所述組織清洗液包括：以組織清洗液的總體積計，含5-50mg/ml(優(yōu)選6-30mg/ml，更優(yōu)選8-20mg/ml)bsa的基礎培養(yǎng)基、penicillin(20-800units/ml，較佳地，50-500units/ml，更佳地，80-200units/ml)-streptomycin(20-800μg/ml，較佳地，50-500μg/ml，更佳地，80-200μg/ml)

41、在另一優(yōu)選例中，所述基礎培養(yǎng)基選自下組：dmem、ham's?f-12、dmem/f-12、或其組合。

42、在另一優(yōu)選例中，步驟(s2)中，使用消化酶tryple(購自賽默飛公司貨號：12604013)進行消化。

43、在另一優(yōu)選例中，步驟(s1)中，輻照劑量為20-80gy，優(yōu)選30-60gy。

44、在另一優(yōu)選例中，步驟(s3)中，含有支氣管上皮干/祖細胞的細胞懸浮液的接種量為8000-50000個細胞/cm2，較佳地，10000-20000個細胞/cm2。

45、在另一優(yōu)選例中，步驟(s3)中，還包括步驟：在37℃、5％-10％濃度的co2的條件下進行培養(yǎng)。

46、在另一優(yōu)選例中，步驟(s3)中，每周更換2-3次培養(yǎng)基。

47、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s3)中還包括：對細胞進行內(nèi)毒素和支原體檢測的步驟。

48、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s3)還包括步驟：

49、(s3a)將所述含有支氣管上皮干/祖細胞的細胞懸浮液接種到所述滋養(yǎng)層細胞上，在本發(fā)明第一方面所述的培養(yǎng)支氣管上皮干/祖細胞的培養(yǎng)基的存在下進行原代培養(yǎng)5-10天；

50、(s3b)對經(jīng)原代培養(yǎng)的細胞克隆進行消化，將消化后獲得的細胞懸液接種到所述滋養(yǎng)層細胞上，進行傳代；

51、(s3c)在本發(fā)明第一方面所述的培養(yǎng)支氣管上皮干/祖細胞的培養(yǎng)基的存在下，進行多次傳代(優(yōu)選3次以上，更優(yōu)選3-6次，更優(yōu)選3-5次，比如4次)，從而獲得所述支氣管上皮干/祖細胞。

52、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(s3c)中，經(jīng)培養(yǎng)擴增獲得的所述支氣管上皮干/祖細胞的數(shù)量為≥1x108個細胞，較佳地，1x108-10x108個細胞，更佳地，2x108-5x108個細胞。

53、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟(s4)：將經(jīng)培養(yǎng)擴增獲得的所述支氣管上皮干/祖細胞與藥學上可接受的載體進行混合，從而制成一生物制劑。

54、在另一優(yōu)選例中，所述生物制劑(即細胞制劑)為輸注制劑。

55、在另一優(yōu)選例中，步驟(s4)中，還包括進行內(nèi)毒素檢測的步驟。

56、在另一優(yōu)選例中，步驟(s4)中，還包括對所述支氣管上皮干/祖細胞進行分析和/或鑒定的步驟。

57、在另一優(yōu)選例中，所述分析和/或鑒定包括：p63和/或krt5標志物鑒定。

58、在另一優(yōu)選例中，所述方法為體外方法。

59、在另一優(yōu)選例中，所述方法為非診斷和非治療的目的。

60、本發(fā)明第四方面提供了一種支氣管上皮干/祖細胞，所述支氣管上皮干/祖細胞采用如本發(fā)明第三方面所述的方法獲得。

61、本發(fā)明第五方面提供了一種如本發(fā)明第一方面所述的培養(yǎng)基，或如本發(fā)明第二方面所述的培養(yǎng)基試劑盒的用途，所述用途包括：

62、(a)用作或用于配制培養(yǎng)支氣管上皮干/祖細胞的培養(yǎng)基；和/或

63、(b)用作或用于配制支氣管上皮干/祖細胞培養(yǎng)基的添加劑；和/或

64、(c)用于培養(yǎng)支氣管上皮干/祖細胞；

65、在另一優(yōu)選例中，所述用途為非疾病診斷、非疾病治療目的。

66、本發(fā)明第六方面提供了一種組合物，所述組合物包括：胎牛血清、葡萄糖、胰島素、表皮生長因子、氫化可的松、y-27632、sb431542、noggin、r-spondin1、fibronectin、e-cadherin。

67、本發(fā)明第七方面提供了一種如本發(fā)明第六方面所述的組合物的用途，所述用途包括：

68、(a)用于制備培養(yǎng)支氣管上皮干/祖細胞的培養(yǎng)基；和/或

69、(b)用于培養(yǎng)支氣管上皮干/祖細胞；和/或

70、(c)用作支氣管上皮干/祖細胞的培養(yǎng)基的添加劑。

71、在另一優(yōu)選例中，所述用途為非疾病診斷、非疾病治療目的。

72、應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。