本發(fā)明涉及一種分析方法，具體說(shuō)是涉及dna單核苷酸多態(tài)性分型的方法。
背景技術(shù)：
1、單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide?polymorphism，snp)是指基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性。是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)。人類基因組中的發(fā)生頻率較高，平均大約每1000個(gè)堿基中就有一個(gè)snp位點(diǎn)，一個(gè)人的基因組dna大約有五百萬(wàn)個(gè)snp位點(diǎn)。目前的研究表明，大部分snp對(duì)人類健康或生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有影響，但有些snp位點(diǎn)會(huì)影響基因的功能，進(jìn)而導(dǎo)致生物性狀的改變、疾病的發(fā)生、藥物的耐受和環(huán)境的易感。因此，snp分型分析是疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、個(gè)體藥物反應(yīng)預(yù)測(cè)、疾病基因的起源和遷移等方面有重要的價(jià)值，被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和臨床檢測(cè)中。
2、目前，常用的基因分析方法主要依賴于pcr反應(yīng)構(gòu)建，包括測(cè)序法、taqman探針?lè)?、芯片法和質(zhì)譜法。crispr/cas12a檢測(cè)體系因具有高靈敏度、高特異性、可編程性、耗時(shí)短和反應(yīng)溫和等優(yōu)勢(shì)，已快速發(fā)展為新一代核酸檢測(cè)技術(shù)。crispr/cas12a檢測(cè)體系是通過(guò)crrna引導(dǎo)識(shí)別目標(biāo)dna而觸發(fā)cas12a蛋白的反式裂解活性，對(duì)兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的短dna單鏈進(jìn)行水解，產(chǎn)生熒光信號(hào)而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)dna的檢測(cè)。然而，由于cas12a蛋白的反式裂解活性的非特異性，crispr/cas12a檢測(cè)體系在2個(gè)及以上目標(biāo)物同時(shí)分析時(shí)遇到困難。通常情況下，一個(gè)snp位點(diǎn)有3個(gè)基因型(野生型、突變型、雜合型)。因此，crispr/cas12a檢測(cè)體系很難進(jìn)行一鍋法snp基因分型，常需要依賴其他技術(shù)(例如微流控技術(shù))的輔助來(lái)完成，較為復(fù)雜?？梢?jiàn)，開(kāi)發(fā)一鍋法crispr/cas12a實(shí)現(xiàn)snp基因分型可以簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟，降低成本，具有很大的應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)前景。
3、本發(fā)明基于crispr/cas12a檢測(cè)體系，針對(duì)野生型和突變型的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)flapprimer引物，在其5’端引入18-21個(gè)核苷酸，通過(guò)fen1酶作用獲得5’端產(chǎn)物p1和p2，作為sda擴(kuò)增的觸發(fā)引物；通過(guò)sda擴(kuò)增將單核苷酸多態(tài)性信息快速轉(zhuǎn)換成2種不同擴(kuò)增產(chǎn)物t1和t2；根據(jù)t1和t2的序列分別設(shè)計(jì)crrna1和crrna2作為crispr/cas12a反應(yīng)體系的引導(dǎo)鏈，進(jìn)而通過(guò)熒光信號(hào)的“強(qiáng)”和“弱”可實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性的分型。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的正是基于fen1-sda-crispr/cas12a多重信號(hào)放大系統(tǒng)構(gòu)建單核苷酸多態(tài)性快速分型方法。
2、本發(fā)明的目的可通過(guò)下述技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)：
3、本發(fā)明是一種基于fen1-sda-crispr/cas12a多重信號(hào)放大的單核苷酸多態(tài)性快速分型方法，通過(guò)crispr/cas12a反應(yīng)體系熒光信號(hào)“強(qiáng)”和“弱”，實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性的分型，其特征在于：所述單核苷酸多態(tài)性快速分型新方法包含識(shí)別、轉(zhuǎn)換和檢測(cè)3個(gè)步驟；其中所述識(shí)別步驟是根據(jù)野生型和突變型的序列設(shè)計(jì)flap?primer?1、flap?primer?2和invading?primer，在fen1酶的作用下可分別產(chǎn)生2種不同的5’端酶切產(chǎn)物p1和p2；其中所述轉(zhuǎn)換步驟是根據(jù)p1和p2的序列設(shè)計(jì)2條不同的sda擴(kuò)增模板，酶切產(chǎn)物p1和p2觸發(fā)sda擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性信息快速轉(zhuǎn)換成2種不同擴(kuò)增產(chǎn)物t1和t2；其中所述檢測(cè)步驟是根據(jù)t1和t2的序列分別設(shè)計(jì)crrna1和crrna2作為crispr/cas12a反應(yīng)體系的引導(dǎo)鏈，通過(guò)熒光信號(hào)的“強(qiáng)”和“弱”可實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性的分型。
4、本發(fā)明具有以下有益效果：
5、本發(fā)明是一種基于fen1-sda-crispr/cas12a多重信號(hào)放大的單核苷酸多態(tài)性快速分型方法，包含識(shí)別、轉(zhuǎn)換和檢測(cè)3個(gè)步驟；所述識(shí)別步驟是根據(jù)野生型和突變型的序列設(shè)計(jì)flap?primer?1、flap?primer?2和invading?primer，在fen1酶的作用下可分別產(chǎn)生2種不同的5’端酶切產(chǎn)物p1和p2，保證所有snp位點(diǎn)均可以使用本發(fā)明的方法進(jìn)行基因分型，保證了單核苷酸多態(tài)性分型的普適性。
6、本發(fā)明的轉(zhuǎn)換步驟是根據(jù)p1和p2的序列設(shè)計(jì)2條不同的sda擴(kuò)增模板，酶切產(chǎn)物p1和p2觸發(fā)sda擴(kuò)增高效率獲得2種不同擴(kuò)增產(chǎn)物t1和t2，不僅實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性信息的快速轉(zhuǎn)換，還可以通過(guò)擴(kuò)增放大降低樣本量的要求，實(shí)現(xiàn)痕量檢測(cè)。
7、本發(fā)明在crispr/cas12a檢測(cè)階段，針對(duì)sda擴(kuò)增產(chǎn)物t1和t2的序列特征分別設(shè)計(jì)了crrna1和crrna2作為crispr/cas12a反應(yīng)體系的引導(dǎo)鏈，通過(guò)crrna1和crrna2的濃度控制，不僅保證了單核苷酸多態(tài)性分型的特異性，還可以根據(jù)熒光信號(hào)的“強(qiáng)”和“弱”可實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性的分型。
8、本發(fā)明通過(guò)flap?primer、sda模板、crrna的設(shè)計(jì)，以及crrna1和crrna2的濃度控制，解決了crispr/cas12a反應(yīng)體系在單核苷酸多態(tài)性分型的普適性、特異性和高效性，無(wú)需其他技術(shù)輔助即可即可實(shí)現(xiàn)crispr/cas12a系統(tǒng)的snp基因分型，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，降低了檢測(cè)成本，可廣泛應(yīng)用到科研和臨床實(shí)驗(yàn)室，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
1.一種基于fen1-sda-crispr/cas12a多重信號(hào)放大的單核苷酸多態(tài)性快速分型方法，包含識(shí)別、轉(zhuǎn)換和檢測(cè)3個(gè)步驟，通過(guò)crispr/cas12a反應(yīng)體系熒光信號(hào)的“強(qiáng)”和“弱”判斷，實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性的分型分析，其特征在于：所述識(shí)別步驟是根據(jù)野生型和突變型的序列設(shè)計(jì)flap?primer?1、flap?primer2和invading?primer，在fen1酶的作用下可分別產(chǎn)生2種不同的5’端酶切產(chǎn)物p1和p2；其中所述轉(zhuǎn)換步驟是根據(jù)p1和p2的序列設(shè)計(jì)2條不同的sda擴(kuò)增模板，酶切產(chǎn)物p1和p2觸發(fā)sda擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性信息快速轉(zhuǎn)換成2種不同擴(kuò)增產(chǎn)物t1和t2；其中所述檢測(cè)步驟是根據(jù)sda擴(kuò)增產(chǎn)物t1和t2的序列分別設(shè)計(jì)crrna1和crrna2作為crispr/cas12a反應(yīng)體系的引導(dǎo)鏈，通過(guò)熒光信號(hào)的“強(qiáng)”和“弱”可實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性的分型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的flap?primer?1和flap?primer?2，其特征在于：目標(biāo)位點(diǎn)的5’端長(zhǎng)度為18-21個(gè)核苷酸，且flap?primer?1和flap?primer?2在目標(biāo)位點(diǎn)-3到-1位的序列不同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的sda擴(kuò)增模板，其特征在于：sda擴(kuò)增模板包含5’段、中段和3’段，其中5’段為擴(kuò)增模板，中段序列包含2個(gè)nb.bbvci酶切位點(diǎn)，3’段和fen1酶切的5’端產(chǎn)物互補(bǔ)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的crrna1和crrna2，其特征在于：crrna1和crrna2分別用于靶向sda擴(kuò)增產(chǎn)物t1和t2，crrna1和crrna2在crispr/cas12a反應(yīng)體系中的濃度有較大差別且應(yīng)小于cas12a蛋白濃度的1/2。