1.一種腸膜明串珠菌,其特征在于:腸膜明串珠菌(leuconostoc?mesenteroides)lms.hfut,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏日期為2023年2月24日,生物保藏編號(hào)為cctcc?no:m2023193。
2.權(quán)利要求1所述的腸膜明串珠菌重組表達(dá)亞鐵螯合酶的方法,其特征在于,包括以下步驟:(1)dna提?。?2)制備感受態(tài)細(xì)胞;(3)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化;(4)重組fech的誘導(dǎo)表達(dá);(5)重組fech的收集和純化;(6)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析重組酶的純度和分子量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腸膜明串珠菌重組表達(dá)亞鐵螯合酶的方法,其特征在于:所述步驟(1)具體為,將腸膜明串珠菌lms.hfut菌株在mrs液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第三代并以1.0%v/v的接種量接種至液體培養(yǎng)基,然后以150~200rpm速度在37℃培養(yǎng)12~16h;隨后設(shè)計(jì)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增,所述引物序列如seq?id?no:1-10所示;
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腸膜明串珠菌重組表達(dá)亞鐵螯合酶的方法,其特征在于:所述步驟(2)具體為,挑取bl21單菌落接種于lb液體培養(yǎng)基中,于37℃搖床中培養(yǎng)12~16h;將培養(yǎng)后的菌液按照1%v/v接種于lb液體培養(yǎng)基中,繼續(xù)在37℃搖床中培養(yǎng)至od600為0.4;將菌液在超凈臺(tái)中分裝至離心管中,在冰上靜置20min;冰浴結(jié)束后,以4℃,4000g離心5min,去除上清;向沉淀中加入100μl預(yù)冷的0.1m?cacl2溶液,輕輕吹打重懸液體,再次冰浴20min,隨后再次以4℃,4000g離心5min,棄去上清;向沉淀中再次加入100μl預(yù)冷的0.1mcacl2溶液,輕輕吹打重懸液體,感受態(tài)細(xì)胞制備完成;保存在-80℃冰箱備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腸膜明串珠菌重組表達(dá)亞鐵螯合酶的方法,其特征在于:所述步驟(3)具體為,取出制備好的bl21感受態(tài)細(xì)胞于冰上,加入目的基因與pqe-80l載體連接的產(chǎn)物pqe-80l-fech,冰盒中靜置30min;隨后將其置于42℃水浴熱激90s,再立即取出于冰上冷卻3min,接著加入900μl?37℃預(yù)熱的無(wú)抗性lb液體培養(yǎng)基,輕輕吹打混勻,放入37℃恒溫?fù)u床中復(fù)蘇30min;復(fù)蘇后,吸取100μl菌液加至含100μg/ml氨芐青霉素溶液的lb固體平板中,在37℃恒溫箱中培養(yǎng)12~18h;其中,目的基因的序列如seq?id?no:11所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的腸膜明串珠菌重組表達(dá)亞鐵螯合酶的方法,其特征在于:所述步驟(4)具體為,從含有重組菌至lb液體培養(yǎng)基中,于37℃、170~220rpm條件下培養(yǎng)8~10h,得到種子液;將1%v/v的種子液接種至lb培養(yǎng)基中,在37℃、170~220rpm條件下培養(yǎng);當(dāng)菌體濃度od600達(dá)到0.6時(shí),加入終濃度為0.5mm?iptg進(jìn)行誘導(dǎo);繼續(xù)在37℃、150~200rpm條件下發(fā)酵12~16h,收集發(fā)酵液,離心,上清液即為胞外重組fech粗酶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的腸膜明串珠菌重組表達(dá)亞鐵螯合酶的方法,其特征在于:所述步驟(5)具體為,誘導(dǎo)結(jié)束后,將發(fā)酵液在10000g、4℃條件下離心10~15min,收集菌體沉淀;隨后使用tris-hcl緩沖液重懸菌體,再次離心,重復(fù)此操作兩次以洗滌菌體;然后對(duì)洗滌后的菌體重懸液進(jìn)行冰浴超聲破碎,參數(shù)設(shè)置為:功率200~300w,工作時(shí)間2~4s,間隔時(shí)間3~5s,工作時(shí)間10~15min,循環(huán)2~3次;
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的腸膜明串珠菌重組表達(dá)亞鐵螯合酶的方法,其特征在于:所述步驟(6)具體為,將粗酶液及純化酶與蛋白上樣緩沖液混合均勻,隨后在沸水浴中加熱2~5min后進(jìn)行上樣;制備濃縮膠和分離膠,設(shè)置電泳電壓為70~100v;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將凝膠浸入考馬斯亮藍(lán)染色液中染色1h,然后在脫色液中震蕩脫色,直至凝膠背景藍(lán)色褪去,最后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照,記錄電泳結(jié)果。
9.權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)所述腸膜明串珠菌重組表達(dá)亞鐵螯合酶的方法制得的亞鐵螯合酶。
10.權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)所述腸膜明串珠菌重組表達(dá)亞鐵螯合酶的方法或者權(quán)利要求9所述的亞鐵螯合酶在制備肉品發(fā)色劑或者在肉制品發(fā)色中的應(yīng)用。