本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種提高活性和穩(wěn)定性的限制性內(nèi)切酶xcmi突變體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、限制性內(nèi)切酶（簡(jiǎn)稱“限制酶”）可以識(shí)別并切割特定的dna序列，來源于細(xì)菌的“限制-修飾”（r-m）系統(tǒng)，是合成生物學(xué)、核酸藥物、體外診斷、生物醫(yī)學(xué)科研等領(lǐng)域的重要工具和原料。根據(jù)r-m系統(tǒng)的組成方式、dna識(shí)別序列與切割位點(diǎn)特征、輔助因子需求等，可以將限制酶分為type?i、ii、iii、iv等4個(gè)大類，其中作為生物醫(yī)學(xué)工具的主要是type?ii類。
2、xcmi是一種較為常用的typp?ii類限制酶，識(shí)別和切割序列為ccannnnn/nnnntgg，其編碼基因來源于野油菜黃單胞菌（ xanthomonas?campestris），一般通過大腸桿菌重組表達(dá)生產(chǎn)。野生型xcmi的比活力較低，僅有約1×104u/mg，導(dǎo)致生產(chǎn)成本偏高。另一方面，野生型xcmi的熱穩(wěn)定性不佳，在37℃下存放1天即損失大部分活性，在4℃下保存時(shí)間也極為有限，影響了該酶的儲(chǔ)存和運(yùn)輸。此外，實(shí)際使用中還發(fā)現(xiàn)，如果一管xcmi反復(fù)開蓋吸取使用，即使嚴(yán)格注意在低溫下使用和保存，xcmi還會(huì)在有效期內(nèi)逐漸喪失活性。經(jīng)分析，認(rèn)為是多次開蓋導(dǎo)致xcmi頻繁暴露于空氣中，從而被氧化而逐漸失活。
3、因此，對(duì)限制酶xcmi進(jìn)行改造，獲得比活力和穩(wěn)定性更高的突變體具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種提高活性和穩(wěn)定性的限制性內(nèi)切酶xcmi突變體，解決了現(xiàn)有限制性內(nèi)切酶xcmi的比活力較低，穩(wěn)定性較差的原因。
2、本發(fā)明還提供所述限制性內(nèi)切酶xcmi突變體的應(yīng)用。
3、技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述一種提高活性和穩(wěn)定性的限制性內(nèi)切酶xcmi突變體，所述限制性內(nèi)切酶xcmi，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
4、其中，所述限制性內(nèi)切酶xcmi突變體與野生型xcmi（ncbi登錄號(hào)aen19707.1）相比，以丙氨酸取代第114位的半胱氨酸（c114a），以丙氨酸取代第166位的半胱氨酸（c166a）。
5、本發(fā)明所述提高活性和穩(wěn)定性的限制性內(nèi)切酶xcmi突變體，所述限制性內(nèi)切酶xcmi，其編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
6、本發(fā)明所述的提高活性和穩(wěn)定性的限制性內(nèi)切酶xcmi突變體在識(shí)別并切割dna序列中的應(yīng)用。
7、其中，所述dna序列為ccannnnn/nnnntgg。
8、其中，所述限制性內(nèi)切酶xcmi突變體在25-37℃環(huán)境下孵育24-48?h后在識(shí)別并切割dna序列中的應(yīng)用。
9、其中，所述限制性內(nèi)切酶xcmi突變體經(jīng)氧化后在識(shí)別并切割dna序列中的應(yīng)用。
10、進(jìn)一步地，所述限制性內(nèi)切酶xcmi突變體在5-20?mm的h2o2孵育后在識(shí)別并切割dna序列中的應(yīng)用。
11、本發(fā)明所述的含有提高活性和穩(wěn)定性的限制性內(nèi)切酶xcmi突變體的試劑盒。
12、其中，所述試劑盒包括限制性內(nèi)切酶xcmi突變體酶液、buffer、無核酸酶水以及內(nèi)切酶試劑盒所需必要組成。
13、本發(fā)明所述的試劑盒在在識(shí)別并切割dna序列中的應(yīng)用。
14、本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過分子克隆、基因合成等各種常規(guī)生物學(xué)技術(shù)得到本發(fā)明所述的限制酶xcmi突變體的編碼基因，并通過常規(guī)的重組表達(dá)和蛋白純化技術(shù)獲得本發(fā)明所述限制酶xcmi突變體蛋白。
15、本發(fā)明所述的限制性內(nèi)切酶xcmi突變體，比活力是野生型蛋白的3倍以上，至少達(dá)到3.42×104u/mg。
16、本發(fā)明所述的限制性內(nèi)切酶xcmi突變體，熱穩(wěn)定性相比野生型蛋白有顯著提高，37℃下存放48?h仍能保持100%活性，而野生型在37℃下存放48?h后活性只剩10%。
17、本發(fā)明所述限制性內(nèi)切酶xcmi突變體，氧化穩(wěn)定性相比野生型蛋白也有顯著提高，在20?mm?h2o2處理30?min的模擬強(qiáng)氧化環(huán)境中，仍能保留30%以上活性，而野生型在同樣條件下活性只剩10%。
18、本發(fā)明提供的限制性內(nèi)切酶xcmi突變體可以用于開發(fā)更加高效的試劑盒產(chǎn)品。
19、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
20、本發(fā)明中的xcmi突變體比活力是野生型xcmi的3倍以上，該突變體在37℃存放48h后仍能保留100%活性，而野生型僅剩10%活性，經(jīng)過20?mm?h2o2處理30?min后，該突變體仍能保留30%左右活性，而野生型活性僅剩10%。本發(fā)明所述xcmi突變體相對(duì)野生型，活性、熱穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性都有顯著提高，有利于降低生產(chǎn)成本，提高儲(chǔ)存和使用期間的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期。
1.一種提高活性和穩(wěn)定性的限制性內(nèi)切酶xcmi突變體，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶xcmi突變體與野生型xcmi相比，以丙氨酸取代第114位的半胱氨酸c114a，以丙氨酸取代第166位的半胱氨酸c166a；所述限制性內(nèi)切酶xcmi突變體，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高活性和穩(wěn)定性的限制性內(nèi)切酶xcmi突變體，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶xcmi突變體，其編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
3.一種權(quán)利要求1所述的提高活性和穩(wěn)定性的限制性內(nèi)切酶xcmi突變體在識(shí)別并切割dna序列中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述dna序列為ccannnnn/nnnntgg。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶xcmi突變體在25-37℃環(huán)境下孵育24-48?h后在識(shí)別并切割dna序列中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶xcmi突變體經(jīng)氧化后在識(shí)別并切割dna序列中的應(yīng)用。
7.一種含有權(quán)利要求1所述的提高活性和穩(wěn)定性的限制性內(nèi)切酶xcmi突變體的試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括限制性內(nèi)切酶xcmi突變體酶液、buffer、無核酸酶水以及內(nèi)切酶試劑盒所需必要組成。
9.一種權(quán)利要求7所述的試劑盒在識(shí)別并切割dna序列中的應(yīng)用。